1. Insulin và bệnh tiểu đường:

Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe doạ nghiêm trọng đến sức khỏe của con người. Năm 2000, con số những người mắc bệnh tiểu đường trên thế giới ước tính khoảng từ 151 đến 171 triệu, và dự kiến đến năm 2010 con số này sẽ là 221 triệu và đến năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch…Theo ước tính, số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường trong năm 2000 là 2,9 triệu và con số này sẽ còn tiếp tục tăng theo từng năm.

Bệnh tiểu đường là một căn bệnh chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Tiểu đường gây ra do tác động phức tạp giữa gene và các yếu tố môi trường, từ đó dẫn đến bất bình thường trong quá trình điều hoà lượng Glucose trong cơ thể liên quan tới những vấn đề về hormon Insulin.

Insulin là một hormon được ra bởi tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tuỵ. Đây là hormon quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sử dụng đường, acid amin và acid béo và duy trì lượng đường trong máu.

2. Sự ra đời của insulin:

Năm 1922, Fred Banting và Charles Best thuộc Đại học Tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra Insulin và ứng dụng thành công chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người. Vào thời điểm đó, người bệnh tiểu đường phải vật lộn với căn bệnh để tồn tại và chưa có biện pháp điều trị hiệu quả nào. Bệnh nhân nhanh chóng trở thành những bộ xương di động và thường chết sớm do bị sút cân nghiêm trọng. 

Vào tháng 5 năm 1922, Leonard Thompson, 14 tuổi, đã được điều trị thành công ở bệnh viện Toronto bằng tinh chất này và nó được gọi là Insulin. Năm 1928, Oskar Wintersteiner đã chứng minh rằng insulin là một protein.

Cấu trúc của insulin là một polypeptide bao gồm một chuỗi A với 21 acid amin và một chuỗi B với 30 acid amin, có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối disulfur nối giữa 2 chuỗi A và B. Insulin ban đầu được tổng hợp dưới dạng tiền insulin (Preproinsulin) trên ribosom trong tế bào beta ở đảo langerhans của tuyến tuỵ. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptid C với 31 acid amin và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A. Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptid tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A). Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba. Proinsulin bị phân cắt bởi Enzym PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptid C và sau đó bị phân cắt bởi enzym PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptid C. Hai acid amin đầu N của peptide nối với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B bởi enzym carboxypeptidaseH.

Cấu trúc của phân tử Insulin

3. Vai trò của insulin:

- Trên chuyển hoá glucid: Insulin có tác dụng làm giảm glucose máu do insulin giúp glucose dễ xâm nhập vào tế bào đặc biệt là các tế bào gan, cơ và mô mỡ bằng cách làm giàu chất vận chuyển glucose ở màng tế bào. Cơ chế của nó là do insulin kết hợp với receptor, phức hợp insulin-receptor sẽ tự phosphoryl hoá tạo tín hiệu dẫn truyền tới nang dự trữ trong tế bào. Các nang sẽ di chuyển tới màng tế bào, hoà vào màng tế bào và hướng chất vận chuyển glucose ra ngoài màng tế bào do đó làm tăng cường vận chuyển glucose làm cho glucose vào tế bào với tốc độ nhanh. Khi nồng độ glucose nội bào cao sẽ thúc đẩy insulin ra khỏi receptor, những chất vận chuyển glucose lại được thu hồi vào những nang bọc kín để trở lại kho dự trữ ở nội bào. Insulin còn thúc đẩy tổng hợp và ức chế phân huỷ glycogen bằng cách kích thích glycogen synthetase và ức chế glycogen phosphorylase.

Khi thiếu insulin, tế bào không sử dụng được glucose và glucose cũng không chuyển thành glycogen để dự trữ ở gan được. Hậu quả là tăng glucose máu và glucose niệu.

- Trên chuyển hoá Lipid: insulin làm tăng tổng hợp và dự trữ lipid ở gan, ngăn cản phân giải mỡ và ức chế tạo các chất cetonic nhờ ức chế hoạt tính của enzym Lipase nhậy cảm với hormon, làm giảm nồng độ acid béo tự do và glycerol trong huyết tương.

- Trên chuyển hoá protid: Insulin thúc đẩy đồng hoá protid bằng cách làm acid amin dễ xâm nhập vào tế bào để tổng hợp protein. Đặc biệt ở thành mạch, insulin tham gia tạo glycoprotein cấu trúc, do đó nếu thiếu insulin thành mạch dễ bị tổn thương.

 4. Những tiến bộ trong công nghệ sản xuất insulin:

Xuất phát từ vai trò to lớn của insulin, hiện nay nhu cầu sử dụng insulin trong điều trị căn bệnh tiểu đường là rất cao. Tính trong năm 2005, nhu cầu insulin dùng trong trị bệnh tiểu đường ước tính khoảng 4.000 – 5.000 kg và dự kiến đến năm 2010 sẽ là 16.000 kg. Nhu cầu về insulin của thế giới vượt qua con số vài tấn/năm. Do đó, nguồn cung cấp insulin cho điều trị bệnh tiểu đường đang thiếu hụt.

Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập tuyến tuỵ của động vật như Bò và Lợn. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần amino acid so với insulin Bò ( hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin Lợn (một vị trí trong chuỗi B). Do vậy nó đã gây ra một số tác dụng phụ không mong muốn khi dùng insulin có nguồn gốc từ Bò hay Lợn. Ngoài ra, quá trình sản xuất và làm tinh khiết insulin trong thời kỳ này còn gặp nhiều khó khăn.

Năm 1982, insulin được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tại công ty Genetech (Hoa Kỳ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường. Trong lịch sử, đây là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công.

Bằng kỹ thuật tái tổ hợp AND, người ta chuyển gene mã hoá insulin vào tế bào vi khuẩn, khi được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, vi khuẩn E.coli sẽ sinh tổng hợp tạo ra loại peptid này. Qui trình sản xuất có thể tóm tắc như sau:

- Chuẩn bị đoạn oligonucleotide mã hoá cho insulin: dựa vào trình tự cấu trúc của các amino acid của insulin gồm 51 amino acid với 2 chuỗi polypeptid A và B nối với nhau bằng hai cầu disulfur. Người ta tạo dòng gene riêng biệt mã hoá cho hai chuỗi A và B.

- Chuẩn bị vertor: có thể dùng plasmid của vi khuẩn hay nấm men.

- Dùng enzym hạn chế cắt plasmid và nối đoạn gene mã hoá cho insulin để tạo vertor tái tổ hợp (thường dùng là pBR322).

- Chuyển vertor tái tổ hợp pBR322 vào vi khuẩn E.coli.

- Nuôi cấy  (lên men) vi khuẩn E.coli trong môi trường thích hợp.

- Tách chiết và thu sản phẩm là 2 loại polypeptid A và B riêng biệt.

- Trộn hai loại peptid lại với nhau và xử lý bằng phương pháp hoá học hay enzym để tạo cầu disulfur.

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm.

Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt

Về sau, nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đã được phát triển. Ví dụ tập đoàn Eli Lily đã phát triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptid C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và carboxypeptidase để tạo thành insulin.

Một phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp này biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với nhau bằng hai acid amin, được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfur được hình thành trong quá trình biểu hiện và trình tiết miniproinsulin, và miniproinsulin này được chiết tách và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy.

Hiện tại, người ta vẫn tiếp tục phát triển những phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp. Ví dụ Công ty Hoechst đã đưa ra một phương pháp sản xuất insulin bao gồm: biểu hiện một dạng dẫn xuất mới của insulin hoặc biểu hiện preproinsulin trong E.coli, tạo các cầu nối disulfur in vitro, sau đó xử lý bằng lysylendopeptidase hoặc clotripain/carboxypeptidase B, cuối cùng tạo rea insulin.

Mới đây nhất, công ty Bio-Technology General đã đưa ra một phương pháp mới. Trong phương pháp này, một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxyde dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện trong tế bào E.coli.  Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase B.

Sản xuất insulin tái tổ hợp trên vi khuẩn

Hiện nay, hầu hết các phương pháp sản xuất insulin thương mại đều dựa trên  các chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn E.coli kết hợp với các kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp.

DS.CKI Nguyễn Văn Ngọc